קוטלי עשבים פועלים על ידי הפרעה לתהליכים הפיזיולוגיים והביוכימיים של עשבים שוטים באמצעות חומרים כימיים, המובילים למותם או לעיכוב גדילתם. מנגנוני הפעולה של קוטלי עשבים מגוונים, ובעיקר כוללים את הדברים הבאים:
1. הפרעה לפוטוסינתזה: למשל, קוטלי עשבים טריאזין חוסמים את שרשרת הולכת האלקטרונים הפוטוסינתטית, וגורמים למות עשבים שוטים מכיוון שהם לא יכולים לסנתז אנרגיה;
2. עיכוב סינתזה של חומצות אמינו: לדוגמה, גליפוסט מעכב סינתאז EPSP, חוסם את הסינתזה של חומצות אמינו ארומטיות;
3. שיבוש חלוקת תאים: למשל, קוטלי עשבים דיניטרואנילין מעכבים יצירת מיקרוטובוליות, מונעים חלוקת תאים;
4. חיקוי הורמונים צמחיים: לדוגמה, 2,4-D מגרה יתר על המידה צמיחה, מה שמוביל לעשבים מעוותים ומתים. הסלקטיביות של קוטלי עשבים תלויה בהבדלים המטבוליים בין גידולים ועשבים שוטים; לקוטלי עשבים לא סלקטיביים יש אפקט הרג על כל הצמחים.
